递送难题：超越病毒载体的基因治疗

基因治疗 (GT) 一词涵盖了一系列用于修改或影响遗传信息以治疗或预防疾病的策略。基因治疗包括两种系统，一种是通过引入、替换或改变患者细胞内现有的遗传物质起作用的系统（体外进行时通常称为基因修饰细胞疗法），另一种是使用遗传物质来影响或调节基因在体内的表达的系统。可能出于机制原因，其他新兴疗法（如病毒溶瘤疗法）有时会被纳入基因治疗的讨论中。了解这一点很有帮助，因为关于成分和所需功能的一些概括性陈述存在例外，因此很难对基因治疗的许多方面做出明确的陈述。

一些基因编辑技术涉及基因工程系统，如成簇的规则间隔短回文重复序列 (CRISPR) 和 CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9)。这种组合提供了一种强大的基因编辑工具，可以精确永久地修改细胞内的 DNA 序列。另一方面，寡核苷酸疗法提供短 DNA 或 RNA 序列 (寡核苷酸)，这些序列通常会调节基因表达或纠正患者的异常 RNA 功能。此类产品包括反义寡核苷酸 (ASO)、小干扰 RNA (siRNA)、信使 RNA (mRNA) 等。

基因改造疗法有两种基本方法：体内疗法和体外疗法。体内基因改造疗法将基因或基因改变材料直接引入患者体内，从而在活体生物体内产生治疗效果。体外基因改造疗法收集患者或供体细胞，在培养物中进行基因改造，通常数量增加，然后再重新引入患者体内（自体疗法）或患者体内（异体疗法）。

病毒载体——例如腺病毒载体 (AdV)、腺相关病毒载体 (AAV) 和慢病毒载体 (LVV)（如人类免疫缺陷病毒 (HIV)）——已被证明是迄今为止最受欢迎的 GT 递送剂。它们在包装、保护、稳定和将基因改变物质递送到细胞中方面发挥着至关重要的作用(1, 2)。话虽如此，其他递送方法正在探索和开发中。研究人员感兴趣的是确定特定特征（新优势）和相对于病毒载体的增量优势，并减轻现有病毒递送方法的已知局限性。非病毒载体 (NVV) 的一个优势是由于不存在免疫原性病毒蛋白而相对安全。

病毒载体问题

病毒载体可引起接受者的免疫反应，从而产生安全隐患。例如，病毒载体 GT 在给对所用特定病毒类型具有免疫力的个体注射时可能具有免疫原性。初次给药时的免疫反应可能会限制治疗效果，甚至危及患者。病毒载体产品也可能具有免疫刺激作用，在首次给药时诱导反应，从而避免将来使用。在这种情况下，患者将来不能再次接受相同的产品（或使用相同病毒载体的其他产品）。

在某些系统中，病毒 DNA 整合到宿主基因组中可能会破坏正常的基因表达（例如，通过插入诱变），甚至引发疾病(3)。尽管载体病毒被设计成复制缺陷型，但仍然存在轻微的重组风险，并可能导致不希望的病毒复制。将病毒载体特异性地靶向所需的组织或细胞可能很困难，并且每种病毒在携带大型基因或治疗有效载荷的能力方面都有其局限性。一些专家尤其担心低频、迟发性副作用的可能性(1)。有人仍担心有效载荷扩散到非目标组织或器官，甚至担心基因水平转移到其他生物体的可能性。

在设计和针对特定应用的定制方面，病毒载体的灵活性和可用选项可能有限。许多研究人员倾向于根据特定货物、治疗需求和靶细胞类型定制药物输送系统。当输送剂是封闭的病毒系统时，这可能会限制某些参数的调整（例如插入的寡核苷酸大小）。根据所考虑的载体和 GT 类型，病毒遗传物质可以以非工程方式引入宿主基因组，这引发了对插入诱变的担忧。NVV 缺乏影响非预期遗传物质整合到宿主基因组中的机制，从而降低了潜在危险的遗传改变的风险。

大规模生产质量稳定的病毒载体既复杂又昂贵，对广泛的治疗应用构成挑战。它涉及复杂的生物系统，包括细胞培养和病毒复制周期，需要精确的条件来确保载体的稳定性和功能性(4)。保持不同批次病毒载体的一致性和纯度很困难，尤其是考虑到被其他病毒、支原体和有害细胞副产物污染的风险。病毒载体生产需要大量劳动力，体积产量可能很低，尤其是慢病毒和逆转录病毒。扩大规模可能非常复杂且缺乏灵活性。

非病毒载体的优势

我对递送载体的兴趣始于 20 世纪 70 年代末，当时我在纽约州布法罗市罗斯威尔帕克纪念研究所的 Demetrios Papahadjopoulos 实验室工作。当时，他正在展示脂质体可以将包裹的药物和疫苗递送到细胞中，从而消除与“原始”药物剂量相关的一些问题。不久之后，使用脂质体递送 DNA 的想法就出现了，从那时起，这种想法最终发展成为目前在 GT 和基因免疫中使用此类合成囊泡的想法。所有 GT 货物载体，包括病毒载体，在保护、稳定和将遗传物质递送到靶细胞方面都发挥着至关重要的作用。

目前，许多不同的方法正在开发中，用于非病毒（主要是合成的）货物运输，以治疗 GT 的遗传和获得性疾病(5)。使用非病毒递送载体进行体内治疗的一个著名例子是 mRNA COVID-19 疫苗技术。SARS-CoV-2 刺突蛋白被编码在封装在脂质纳米颗粒 (LNP) 内的 mRNA 中，脂质纳米颗粒形成脂质双层，保护脆弱的 mRNA 免于降解，并促进其功能性地递送到受体细胞中。然后，这些细胞表达编码的蛋白质，从而诱导预防性免疫反应。

就立即产生不良免疫反应的风险而言，NVV 通常比病毒载体更安全，免疫刺激性更低。至于载体灵活性，一些 NVV 可以适应病毒系统无法实现的载体设计、靶向和针对特定应用的定制方面。一些研究人员定制脂质或聚合物纳米颗粒（以及其他 NVV），以适应特定的核酸货物、治疗需求和靶细胞类型。一些 NVV 具有比病毒载体更大的有效载荷能力。这可以支持一次递送更大的寡核苷酸序列甚至多种治疗剂，使 NVV 适合递送复杂的治疗有效载荷。

更通用的 NVV 可用于开发用于递送一系列核酸的平台。这种适应性使 NVV 开发人员能够为一系列 GT 计划设计方法。增强组织靶向性和特异性的工程是许多 GT 计划目前关注的问题。NVV 通常可以提供多种可能性来提高基因递送到所需组织或细胞类型的精确度。此类方法已在体外和体内应用中进行了研究，其中一些方法比另一种方法更先进。

请注意，规模考虑是病毒载体制造的一个重要因素。相比之下，一些 NVV 更容易、更便宜地投入生产和大规模生产。该设施可以降低大规模生产的成本——节省的成本可以帮助降低付款人和患者的费用——同时提高 GT 治疗的有效性。

因此，非病毒载体的优势包括降低炎症、毒性和其他免疫相关并发症的风险（5、6）。由于它们引发的免疫反应较低，因此大多数可以多次给药而不会失去有效性，这对于需要持续治疗的慢性病尤其有益。NVV（尤其是由可生物降解材料制成的NVV）具有较低的插入诱变风险，并且毒性较低。与病毒载体相比，基于化学的载体通常更容易大规模生产且成本更低，并且批次之间的差异通常较小。非病毒载体可以设计有特定的靶向配体，以增强对特定组织或细胞类型的递送，从而提高治疗效果并使其不太可能影响非目标组织或器官。