碟片式离心机中细胞培养澄清的剪切评估（二）

阻力系数（Cd _）：_对于斯托克斯流态中的球形颗粒，Cd根据Re值计算，如公式 3（ 9-11 ）所示。

雷诺数是一个无量纲量，计算为流体流动中惯性力与粘性力的比率，假设惯性力引起流动，粘性力阻碍流动。因此，Re值较低的流动被描述为层流和平稳的流动，而 Re 值较高的流动则被视为湍流。Clark 和 Blanch 认为 Re < 0.4 为层流（斯托克斯）状态，Re = 0.4–500 为过渡流（阿伦）状态，Re > 500 为湍流（牛顿）状态（9）。作者还报告说，离心过程中细胞和蛋白质的沉降通常发生在层流（斯托克斯）状态（9）。如公式 4 所示，Mei 提出了一个表达式来确定流动液体中移动粒子的Re值（ 12, 13）。

能量耗散率 (EDR)：在离心过程中的沉降过程中，EDR 表示流动流体在粒子移动并受到阻力时损失动能的速度。该速率取决于粒子速度和阻力大小（公式 5）（8）。每个细胞的特定 EDR ( є _p ) 等于 EDR 除以细胞体积（公式 6）（8）。

柯尔莫哥洛夫涡旋长度 (ℓ _eddy )：在离心过程中，流体的动能从大涡旋中消散，并汇聚到小涡旋中。短于细胞直径的涡旋会杀死细胞。公式 7 显示了如何计算柯尔莫哥洛夫涡旋长度，就我们的目的而言，它代表了离心过程中最短的涡旋。ℓ 涡旋_值可用作可扩展参数，以在 DSC 中保持相同的细胞剪切量 ( 9 )。在公式 7 中，γ 表示流体的运动粘度 (m ² /s)。

细胞损伤指数 (CDI) 和模型拟合：乳酸脱氢酶(LDH) 是存在于哺乳动物细胞中的一种酶。由于它是在细胞破裂时释放的，因此分析师经常在剪切评估期间将其用作细胞损伤的指标。例如，Shekhawata 等人使用 Alfa Laval 的 Culturefuge 100 (BTPX305H) DSC 系统 ( 13 ) 展示了细胞培养澄清过程的剪切应力值。该团队应用计算流体动力学 (CFD) 来预测剪切水平，然后根据离心机转鼓速度和进料流速的不同组合，根据测得的 LDH 值验证了由此得出的预测结果。

我们使用作者的 LDH 值作为响应变量，并使用根据公式 7 计算出的 ℓ_涡流值作为解释变量，应用 JMP 软件（版本 16.0）中的拟合模型函数和标准最小二乘函数来评估涡流长度模型对 DSC 系统中剪切水平的预测（图 2）。图 2 显示了 LDH 浓度与计算出的 ℓ_涡流值之间的线性关系。数据显示涡流长度和截距的 p 值分别为 0.0008 和 <0.0001。两个值均 <0.05，表明输入变量（ℓ_涡流）和输出预测（LDH 浓度）之间的关联强度具有高度的统计意义。因此，在 DSC 过程放大过程中，应用恒定的 ℓ_涡流值可能是剪切评估的有效方法。

离心机的颗粒沉降能力：为了在不同品牌和型号的离心机中保持相同的沉降能力，我们采用了恒定的Q/Σ比率。公式 8 显示了如何计算 DSC ( 4, 9 ) 的该比率。其中，g 表示重力加速度 (9.8 m/s ² )，Θ 表示离心机盘的半锥角（以弧度为单位）。离心机制造商通常以度 (°) 为单位报告该角度，但可以通过将角度乘以 π/180° 的系数将半锥角从度转换为弧度。

斯托克斯固体颗粒沉降定律可以计算出离心过程中可去除的最小粒径（公式 9）（4, 9）。Ambler 报告称，此类计算基于 sigma 理论，因此给出的是标称值而非绝对值 ( 14 )。Pham 补充道，对于给定的Q/Σ比率 ( 4 )，计算出的粒径 ( d _p,min )仅能实现 50% 的分离效率。

设定 DSC 操作的设计空间 — 沉降能力的截止标准： Pham 报告称，使用 DSC 澄清的细胞培养收获物的平均粒径为 0.5 µm（4）。Parau 等人报告称，MilliporeSigma 的 Millistak D0HC 过滤器（可用作两步纤维素基深层过滤工艺的第一阶段）的标称等级为 0.6–9 µm（15）。生物制造商通常根据操作规模交替应用此类过滤器和 DSC（1）。因此，设定截止值 ( d _p,min ) <0.6 µm 是在 DSC 操作设计空间中控制粒径和沉降能力的良好方法。

设置 DSC 操作的设计空间 – 涡流长度：对于处于生长稳定期的 CHO 细胞，Maschke 等人观察到的平均细胞大小为 13.57 µm ± 1.02 µm ( 16 )。Nienow 报告称，在大多数 CHO 细胞培养过程中，保持涡流尺寸 >18 μm 应可防止流体动力损伤 ( 17 )。由于大多数哺乳动物细胞的直径 <20 μm ( 8 )，将 ℓ_涡流设置为 <20 μm 应可确保离心机在防剪切区运行。然而，在一项关于 CDI 的研究中，Shekhawat 等人建议防剪切设计的 LDH 浓度为 ~1,200 ppm ( 13 )。该值相当于 ℓ_涡流长度 22 µm。因此，保守方法要求将 ℓ_涡流值设置为 <22 µm。

设置 DSC 设计空间 — 重力：相对离心力( g力) 是离心机旋转相对于重力产生的径向力（公式 10）（4）。Doran 解释说，DSC 设计为产生 5,000-15,000 g以最大限度地缩短沉降时间和离心机处理时间 ( 18 )。细胞培养收获是一个清洁的过程，但不是无菌的过程。因此，制造商的目标是在四到六个小时内完成大规模（20,000 L）培养的 DSC 收获操作，以最大限度地减少微生物增殖。Pham ( 4 ) 和 Monica、Whiteley 和 Aktiengesellschaft ( 19 ) 表示，他们分别应用 6,500-7,500 g和 8,000-9,000 g进行基于 DSC 的细胞培养收获。我们将重力加速度设置为>5,000 g，以便及时完成过程。

图 3 显示了 ℓ _eddy、g力、Q/Σ和d _p,min值与离心机进料流速和转鼓速度的关系图。这些值是针对我们公司生物制造工厂中使用的 60 L BRPX 618 HGV-34 DSC 系统 (Alfa Laval) 生成的，该系统可进行 20,000 L 的细胞培养。该图显示了与剪切和沉降能力相关的风险区域以及防止细胞损伤同时保持合理沉降能力的操作空间。该图还表明较窄的Q/Σ范围 (3.1 × 10 ^–9 m/s 至 4.1 × 10 ^–9 m/s) 是首选操作区域。对于使用 DSC 进行细胞培养澄清，Pham 建议的Q/Σ值范围为 10 ^–9 m/s 至 2.6 × 10 ^–8 m/s ( 4 )。然而，Maybury 等人和 Iammarino 等人描述的实验表明，随着Q/Σ从 3.4 × 10 ^–9 m/s 增加到 1.35 × 10 ^–8 m/s，澄清效率会降低 6–10%（20, 21）。这些观察结果与图 3 中所示的离心机设计空间一致。