病毒载体设施设计的复杂计算：商业基因治疗制造的考虑因素

在标准化生产和净化平台的指导下，单克隆抗体 (mAb) 和其他重组蛋白治疗药物的开发商在设计和建立商业规模运营设施时可以采取相对简单的途径。相比之下，设计基因治疗 (GT) 设施则涉及更复杂的计算。有多种方法可用于在商业规模上生产转基因病毒载体。GT 开发商必须谨慎选择，因为每种制造策略都会在工艺可扩展性、设备实施、存储、物料和人员流动以及最终的设施产出方面带来独特的优势和局限性。制造策略的多样性——以及进一步平台改进的可能性——要求 GT 公司及其设施设计团队在规划时具有前瞻性。一直以来，GT 设施都必须按照良好生产规范 (GMP) 操作进行设计，并与病毒载体配合使用，包括隔离病毒阳性区域和防止交叉污染的措施。

设施工程公司 CRB 的 Allan Bream（生物制药工艺高级研究员）和 Brita Hobmann（工艺工程师）在生物制药设施设计和建设方面拥有超过 40 年的综合经验，尤其专注于基因改造和基因改造细胞疗法的场地。去年夏天，我与 Bream 和 Hobmann 进行了通信，列举了建立商业基因改造能力所涉及的许多变量中的一部分。在描述了生产平台和相关设备及运营要求的实施趋势后，两人探讨了将污染控制纳入设施计划以及优化设施使用和产出的策略。我们的讨论还强调了基因改造公司在建立内部制造能力或将载体生产外包给合同服务提供商之间做出决定时需要考虑的事项。

为基因治疗生产奠定基础

您如何描述 GT 制造的前景？目前主要采用哪些生产方法？

Bream：腺相关病毒 (AAV) 仍然是体内基因治疗最常见的基因传递载体。慢病毒载体 (LVV)、腺病毒载体 (AdV) 和逆转录病毒载体 (RVV) 是其他可用的传递系统。一个关键的考虑因素是 AAV 不会整合到患者细胞的基因组中，这使得它们在体内应用时有效，但会随着时间的推移限制治疗效果。LVV 和 RVV 会整合到宿主细胞基因组中，因此是体外操作分裂细胞的理想系统。

三重转染仍然是将基因转移到用于生产重组 AAV 的细胞中的主流方法。将三个 DNA 质粒按顺序与生产细胞系（通常是人胚胎肾 293 (HEK293) 细胞）一起孵育。一个质粒含有一对必需的 AAV 基因，第二个质粒含有针对 GT 的转基因，第三个质粒是辅助质粒。

Hobmann：目前 GT 制造的共同主题包括悬浮细胞培养的可扩展性、对一次性 (SU) 设备的需求以及平衡内部和外包活动的愿望。通常，GT 在 SU 生物反应器中的生产量上限为 500 升。然而，一些公司正在运营两个 200 升生物反应器，因为这种规模的生产通常比 500 升系统中观察到的更有效的转导。

SU 设备继续主导 GT 市场。与传统 mAb 生产相比，此类产品所需的工艺量相对较小。SU 可通过处理用过的工艺接触材料来快速清洁生物安全级 (BSL) 材料。SU 技术有利于加快上市速度，这对于试图吸引客户的合同开发和制造组织 (CDMO) 或生产临床材料的初创公司来说都是有利的。

围绕“制造还是购买”问题的讨论仍在继续。基因改造药物开发商必须决定现在投资什么，以及外包什么以节省资金。Allan 和我发现，基因改造药物市场上的许多 CDMO 为其客户处理整个流程。外包方法为生物技术公司提供了一种在场外制造病毒载体的选择——例如，支持生产转基因细胞疗法，例如基于嵌合抗原受体 (CAR) T 细胞的疗法。

或者，GT 生产的某些方面可能有利于先外包，然后再带回内部。溶液制备是最初外包的最常见活动之一。通过从合格的第三方供应商处购买预配制培养基和缓冲液，GT 开发商可以节省空间和注射用水 (WFI) 等商品。在建造自己的制造设施时，GT 公司经常会讨论内部采购和外包，以根据当前和未来的流程需求定制投资。

不同的生产方法如何影响 GT 设施设计？

Bream：悬浮培养比依赖锚定的操作更有利于加工。在摇床或搅拌生物反应器系统中进行悬浮细胞培养也能提供更好的气体和营养交换，从而为细胞提供最佳生长条件。但目前的 SU 生物反应器设备限制了规模扩大。一些生物反应器的工作容量高达 4000 升。然而，大多数商业流程的上限为 1000 升。

尽管悬浮细胞培养相对简单，但有效的转染方法才是关键。随着细胞密度和体积的增加，转染效率会降低。正如 Brita 所解释的那样，这一因素通常迫使制造商使用两个小型生产生物反应器，而不是一个大型装置。

Hobmann：关于贴壁依赖型平台，从贴壁工艺开始可以带来一些临床优势，但不幸的是，在更大规模的商业化运营中，这些优势往往会被劣势所抵消。与悬浮生物反应器的众多可用选项相比，大规模贴壁培养设备的选择仍然有限。因此，基于贴壁平台的商业化规模工艺的最大面积约为 500 平方米，而增加产能则需要添加设备才能扩大规模。收获步骤还可能需要在培养基交换之间将细胞从培养表面移出。在这方面，贴壁生物反应器的作用类似于灌注工艺，与批量操作的悬浮工艺相比，它需要更大的培养基量。大量的培养基需要大量的溶液制备需求，并且需要足够的空间来制造、储存和转移这些溶液。

悬浮细胞和贴壁细胞平台各有优缺点。有时，GT 开发人员会出于业务驱动因素而开发使用这两种方法的灵活性。通过战略性设施规划和远见卓识，可以实现这一点。

包装/辅助和生产细胞系对于材料使用、设备配置和设施布局有哪些考虑？

Hobmann：从历史上看，包装/辅助细胞系一直主导着病毒载体领域，而稳定的生产细胞一直是 GT 公司的愿望。在 CRB 的 2020 年展望：细胞和基因治疗报告的一项调查中，65% 的受访者表示，他们的公司正在开发或打算开发稳定的生产细胞，因为有可能降低成本并提高可扩展性(1)。在基于生产细胞系的过程中，转基因转化发生在过程的早期，即生长周期的开始。与基于包装细胞系和大批量三重转染的过程所需的数量相比，这减少了对昂贵质粒的需求。生产细胞系还可以提高载体产量和批次一致性，因为它们已预先转染了所需的遗传元素，从而有效地消除了三重转染的需要。挑战在于扩大这些“圣杯”细胞系的规模，以实现商业可行性。未来几年，生产细胞的进步将令人兴奋。

建立设施控制

病毒载体制造有哪些生物安全要求？

Bream：病毒载体制造的洁净室分类取决于工艺是开放的还是封闭的。通常，接种物制备在 C 级房间背景的生物安全柜中进行（见开篇照片）。封闭的上游操作（例如细胞培养扩增和病毒载体繁殖）在 D 级环境中进行。当过渡到下游操作时，工艺量会减少，而对真正封闭的小规模操作的需求将洁净室分类推向 C 级。

病毒载体批量灌装在 C 级空间内进行，然后转移到同一设施内的药品灌装。此类区域受欧盟 GMP 附件 1 (2) 约束，并且通常与药物物质制造区域隔离。小批量、手动灌装小瓶需要 A 级环境和 B 级背景。当然，这推动了对与无菌操作兼容的气闸和更衣规程的需求。对于大规模操作，监管机构更喜欢在高效微粒空气 (HEPA) 过滤隔离器系统内自动灌装小瓶。作为封闭系统，隔离器允许 C 级房间背景。

欧盟 GMP 附件 1 的 2023 年更新要求制造商在遵循质量风险管理 (QRM) 原则 (2) 的同时实施污染控制策略 (CCS) 以及使用前、灭菌后完整性测试 (PUPSIT)。

Hobmann：病毒载体通常被归类为 BSL-2 材料，因为它们是“与人类疾病相关的病原体，对人员造成中等危​​害”（3）。BSL-2 材料需要特殊的处理考虑，例如安全排气生物反应器、隔离器和洁净室。GT 制造商应进行风险评估，以评估病毒载体从功能封闭的系统中逃逸的可能性和影响。例如，生物工艺袋泄漏的可能性有多大？将空气从阳性载体区域再循环到无载体区域会产生什么影响？应该讨论这些问题，以建立工程控制措施来最大限度地降低风险。

除了封闭式工艺设备外，供暖、通风和空调 (HVAC) 系统在 GT 制造中也发挥着关键作用，有助于保护人员和环境。空气处理分区、高效空气微粒子过滤器和房间增压是一些机械元件，如果使用得当，可以提供另一层控制。如果房间或隔离器内发生病毒载体泄露，建议使用汽化过氧化氢或等效药剂进行化学净化。净化方法应在设施设计早期进行讨论，并作为风险评估的一部分。

制造商还能通过什么方式来确保隔离媒介阳性区域？

鲷鱼：有几种方法提供了层层保护，以防止交叉污染。

与其他生物制药设施一样，人员、材料和废物气闸室是进出工艺区域的通道。然而，对于 GT 操作，人员、材料和废物的单向流动是首选，而不是 mAb 和其他生物制药产品设施通常使用的双向流动。

双走廊设施方法是典型的，有助于单向流动。人员和材料通过“供应”走廊进入工艺区，而废物通过返回走廊排出，人员返回更衣室。

宿主细胞扩增（感染生产生物反应器之前）与病毒套件隔离。

在工艺套件的入口/出口处执行经过验证的化学消毒/擦拭和净化步骤。

一般来说，病毒载体套件 HVAC 压力相对于设施供应和返回走廊的压力为负值，有助于控制并防止交叉污染的风险。

Hobmann：除了 Allan 提到的方法外，封闭式处理还可作为载体控制的另一种工程控制方式。幸运的是，封闭式处理技术对行业来说并不新鲜，GT 制造商可以从各种 SU 产品中进行选择，以保持封闭性。无菌连接器、管道焊接机和预组装歧管是一些有助于保持基于 SU 的平台封闭性的组件。特定步骤可能需要在功能上开放，在这种情况下，操作应在更高级别的区域进行，例如 A 级隔离器或生物安全柜。

对于小批量生产，市面上很少有封闭式 GMP 级设备可供选择。下游加工后，本来就很小的 GT 产量会进一步减少。因此，GT 制造过程中的净化步骤可能需要较高的房间分类或二级遏制措施，以减轻与功能开放步骤相关的风险。

前瞻性设施设计

GT 制造商在建立生产设施时会犯哪些错误？

Bream：早期 GT 公司面临着快速生产足够材料以支持临床试验的压力。因此，公司经常在工艺开发 (PD) 方面做出妥协。由于没有足够的时间来优化给定的工艺，公司被迫做出决定：追求“完美”的工艺或满足于“足够”的制造方法。问题是，稍后修改工艺可能会造成破坏且成本高昂。随着项目进入第 3 阶段临床试验，它可能会达到无法进行工艺更改的地步。

问题还来自于使用无法扩大规模的工艺方法。PD 通常始于性能不佳的研究级设备中的开放式工艺。不过，在未来的工艺中缓解此类缺陷可能会花费不菲。例如，如果无法关闭开放式步骤，则需要将其安置在高等级的洁净室中。这将增加设施资本成本和运营费用。

从合作伙伴 CDMO 进行有效的技术转让可能会很麻烦。在某个时候，GT 开发商可能希望将流程从其 CDMO 转移回自己的制造工厂。在此过程中，有关流程和相关方法的沟通和记录将至关重要，有关质量控制 (QC) 测试方法的详细信息也至关重要。明确的目标、中期目标和定期安排的进度跟踪会议将是成功的关键。

Hobmann：与 mAb 和传统模式相比，商业 GT 产品在市场上相对较新。因此，GT 制造没有“黄金标准”，每家公司都在开发自己的最佳实践。这些不同的方法可以带来创造性的创新，但如果公司缺乏前瞻性思维，他们可能会在过程中遇到障碍。例如，这让我们回到是否使用基于粘附或悬浮的平台的问题，以及考虑每种格式的长期成功的重要性。GT 开发人员需要在上市速度和未来需求的可扩展性之间取得平衡。

过去五年，竞相争夺成熟商业设施的 GT 公司数量显著增加。这一激增带来了行业最佳实践和专家指导。在建造设施时，请参考此类指导以及之前曾遇到过这些障碍的专家。

制造商如何确保他们正在优化设施的使用和产出？

Bream：需要考虑的因素有很多，包括灵活性和冗余度、流程收敛、风险承受能力以及与 SU 技术相关的问题。公司还需要仔细考虑基本的自制或购买选择。

关于灵活性，尽可能指定能够支持多种工艺能力和产品类型的设备。无论是例行校准、零件更换还是意外故障，工艺设备都需要定期维护，并将停止使用。制造商需要制定策略，确保设备维护不会严重中断生产。其中包括关键设备的 N + 1 冗余。

在自主研发还是外购决策方面，早期和尚未盈利的公司在人员和资本设备方面的预算都很紧张。这类公司应该考虑外包培养基和缓冲液制备（这也有助于减少存储要求）和 QC 放行测试等活动。当然，外包需要额外的规划，以确保供应商能够支持给定的制造要求。

GT 公司应与 SU 技术供应商合作，确保此类设备能够支持特定的制造流程并适合特定的设施设计。GT 开发人员还应研究设备与设施的流程控制系统之间的有效接口。

开发封闭流程将实现并行处理，而无需额外的监管审查。

至于风险承受能力，公司必须探索自己对 GMP 工艺流程、HVAC 能力、设备冗余、开放式加工等方面的风险承受能力。管理人员应尽早获得关键利益相关者的认可。

霍布曼：优化设施效率和产量的关键在于规划。这似乎过于简单，但重要的是，GT 公司应在开始时花时间确定设施驱动因素和产能目标，并获得关键利益相关者的支持。初步规划将为整个设施设计提供路线图，团队应解决绕行问题。

仿真建模可用于通过对 GMP 流程、工艺计划和设备使用进行压力测试，为早期设施设计阶段提供信息。工艺模拟还可以测试上游、下游和填充功能的比率，以防止出现进度瓶颈并减少设备停机时间。其他用例包括评估并行列车以实现吞吐量预测和仓库容量建模以支持传入的消耗品。规划为优化设施设定了框架，并避免了与重大路线修正相关的挑战。

GT 制造商如何帮助确保他们的设施能够满足未来的需求？

Bream：在项目早期阶段（最好是在可行性评估或概念前活动期间），定义设施用户对未来需求的要求至关重要。在这方面，流程建模和探索不同的设施方法非常重要。这些活动可以在开始认真的设计工作之前测试不同的设施条件、能力和概念。考虑到停车场、行政大楼和其他所需支持等场地设施，进行场地总体规划和制造评估也很有价值。对建筑内和建筑外规划的战略方法将实现精简、精心设计的扩展。

霍布曼：生物制造技术和科学的不断创新意味着 GT 行业的变化是不可避免的。关键是要在制造工厂的整个生命周期内适应这种进步。

灵活性已成为行业流行语，对每个人来说，它的含义都不同。如果我们以一个生产套件为例，有多种方法可以使该套件在未来的运营中“灵活”。燃气设施、数据连接和电源插座可以标准化，并围绕套件分布，以适应不同的设备配置。天花板高度和房间占地面积可以设计为方便未来的扩大/缩小。

燃气轮机开发商应与其供应商和设施工程师合作，定义灵活性对于其自身目的的意义。为了防止过度设计，团队不应偏离该定义。燃气轮机是尖端科学的产物，它们将随着科学的发展而不断发展和变化。在既定目标范围内保持灵活性将是降低风险和延长设施寿命的关键。