用于快速开发基于 rAAV 的基因疗法上游工艺的放大/缩小平台（二）

结果与讨论

选择放大/缩小因素是生物工艺开发的一个关键方面，因为该工艺可确保从高通量（毫升级）和台式（升级）生物反应器等系统成功过渡到更大规模（例如百升级）的容器。在从台式（<5 L）到商业规模（>200 L）rAAV 生产的技术转移过程中，确定生物和操作因素变得至关重要。

我们需要有关 STR 几何形状（例如，罐体直径和叶轮数量和直径）、物理化学性质（密度和热容量）、操作条件（搅拌和曝气速率）和细胞接种密度的数据，以便比较不同规模的操作方式。我们使用在文献调查期间发现的经验相关性计算了氧气质量传递和功耗等关键工艺参数。我们对缩放因子的选择一方面受到方式分析提供的理论评估的指导，另一方面受到实验验证的指导。参数选择取决于不同实验迭代的结果，实验主要受方式分析的结果和不同规模性能匹配期间获得的经验（基于细胞生长和 rAAV 生产）指导。虽然我们没有利用这些工具，但我们鼓励使用人工智能 (AI) 和机器学习 (ML) 来加速缩小规模并减少实验工作量——例如，通过使用 Alavijeh 等人(41) 中概述的方法。

尽管如此，对操作条件和状态分析预测的实证确认是我们流程的重要组成部分。例如，实验结果突出了与生物反应器控制相关的问题，特别是不可扩展 PID 控制参数的选择。考虑这些因素对于确保性能匹配至关重要（图 2）。我们使用实证测试和传统调整方法和建模相结合的方式执行 PID 调整和验证，正如 Harcum 等人所讨论的那样。

不同规模下的细胞增殖：选择可扩展的操作条件后，我们在 STR 培养过程中监测了昆虫细胞的生长情况，目的是证明不同规模下的性能相似，以统计上相似的增长率（t检验中的 95% 置信区间）来衡量（图 3）。获得的数据表明，特定增长率的计算结果与规模之间的偏差小于 5%，这证实了所选的操作条件为细胞增殖提供了相似的环境。

我们观察到死细胞计数存在一些细微差异。实际上，这些差异不会影响细胞生长和 rAAV 的生产，但我们进行了额外的实验以确定潜在的根本原因。我们认为细胞死亡率差异的主要原因是大型培养容器中存在微型通气管，而台式和高通量培养容器中存在 L 形通气管 ( 11 )。

已知小的高能气泡会影响培养过程中的细胞活力水平（43–45）。图 4 显示了实验演示，证实了我们的假设，即死细胞计数的差异可归因于通过微分布器添加氧气以控制 %DO_饱和度时产生的流体动力应力。在配备微分布器的容器中观察到的更高活力（图 4 中的橙色线）与流体动力应力导致的细胞裂解有关。死细胞无法修复其生物结构，因此容易裂解，并且使用传统细胞计数方法检测不到。另一方面，配备环形分布器的容器显示出较低的细胞活力。我们的数据表明，环形分布器使死细胞保持完整，因为它施加的流体动力应力低于微分布器。这些结果与文献报道相符，文献报道小气泡与高能爆炸有关，高能爆炸会导致细胞损伤和伴随的细胞死亡（46）。