用于快速开发基于 rAAV 的基因疗法上游工艺的放大/缩小平台
我们讨论了使用昆虫细胞和杆状病毒表达载体系统 (BEVS) 生产重组腺相关病毒 (rAAV) 载体的稳健、快节奏和高通量 (HT) 工艺开发平台的开发。基于理论方案分析，我们重新设计了上游操作以生成代表大规模工艺的台式和 HT 缩小模型。实验验证期间收集的数据表明，生产力水平和测量的关键质量属性 (CQA) 在各种规模之间相匹配，表明从 HT 到商业规模的可扩展性。我们的研究结果可以促进 rAAV 生产过程的工艺表征。如下所示，我们的数据还表明在工艺开发过程中绕过中间规模的可能性，从而有效缩短时间表并降低此类活动的成本。图中的实线表示传统的线性开发路径，而虚线红色表示我们提出的开发路径（RSD = 相对标准偏差）。
近年来，生物工艺开发领域取得了显著进步，这得益于对生物制药（包括重组腺相关病毒 (rAAV) 载体等基因治疗产品）的需求不断增长。迄今为止，全球监管机构已批准了几种基于 rAAV 的基因疗法，并且正在进行多项临床试验，预计未来 5 到 10 年将出现显著增长(1)。
rAAV 生产领域仍以使用人胚肾 (HEK) 和昆虫细胞的平台为主。例如，uniQure 的专有平台基于昆虫细胞生产和杆状病毒表达载体系统 (BEVS) (2–5)。随着基因治疗临床管线的扩展，确保高效、经济高效且可扩展的病毒载体生产流程变得至关重要(1)。这项工作的核心是缩小模型和快速扩大规模。
缩小模型是小规模的表示，旨在模拟生产规模中遇到的关键工艺参数、条件和挑战(6)。此类模型有助于深入了解工艺性能、识别潜在瓶颈并实现工艺改进，而无需进行大规模、资源密集型的试验。因此，缩小模型已成为生物技术行业开发、理解、优化和验证生物工艺的不可或缺的工具(7、8)。
多种生物反应器系统已证明在生物制药（包括细胞和基因治疗 (CGT) 产品）的实验室、中试和商业生产规模上具有一致的可扩展性(9–12)。此类设备的可用性表明，从实验室到商业制造的扩大不仅是可能的，而且在行业中也已得到充分认可。
快速扩大规模是指在最短的时间内缩小实验室规模实验与全面生产之间的差距。几家生物制药公司已经采用了这一理念，这是因为他们从创纪录的时间内成功部署 SARS-CoV-2 疫苗中吸取了经验教训(13, 14)。快速扩大规模在很大程度上得益于丰富的内部专业知识、基于平台的方法(7, 15)以及高通量实验和分析。
在这方面，高通量微型生物反应器为加快工艺开发的数据生成问题提供了尖端解决方案。在此，我们探讨了此类系统在扩大工艺、优化基因治疗生产和简化基于昆虫细胞的生物制造工艺方面的关键作用。我们的目标是建立一个具有代表性的当前生产生物反应器的缩小模型，以支持能够加快可能挽救生命和改变生命的疗法的商业化生产的平台。我们提出了一种相对非常规的工艺开发方法，通过提供数据来支持绕过小规模研究并直接从微型生物反应器扩大到 rAAV 生产的试点/商业规模的可能性。
材料和方法
状态分析：在基因治疗规模扩大/缩小的背景下，状态分析方法是评估和表征不同规模生物过程行为的基本工具，主要是生产规模的生物反应器，这是要研究的目标操作（16–18）。这种分析方法有助于理解关键时间常数以及不同参数和操作条件对过程性能的影响。它指导将工艺缩小到台式和高通量生物反应器的努力，同时帮助工艺工程师选择商业和中间生产规模的最佳操作空间。
在模型表征过程中，使用了几个关键的时间常数，以确保在更大规模上准确表示生物反应器的性能（8）。模型设计期间要解决的关键参数包括单位体积的功率输入（P / V L）、叶轮尖端速度（v tip）、表观气速（v sg）和覆盖气体流速（f ov）。我们进行了文献调查，以收集足够的经验相关性来进行状态分析，并选择了最合适的时间常数进行模型设计和测试（4、8-12、16-36）。
扩大搅拌槽式生物反应器 (STR) 中的细胞培养过程需要仔细考虑设备在质量、温度和动量传递方面的能力——可以分别使用已充分证明的氧气传质系数 ( k L a )、传热系数 ( U ) 和混合时间 (θ m ) 来表征(19–21)。此外，工艺工程师需要充分了解宿主细胞系的生物学特性，例如其抗剪切力、死亡率 ( k D ) 和生长率 (µ max ) (22–24, 26 )。对于涉及 BEV 的过程，需要考虑的一点是，已知宿主细胞在被杆状病毒感染后会发生生理变化(4, 25, 27, 37)。扩大规模设计的另一个复杂因素是，上述许多变量之间都有相互依赖性（图 1）。例如，培养基成分会影响细胞性能，进而影响 STR 的传质能力。
摇瓶中的细胞扩增：本研究中使用的昆虫细胞系在一次性摇瓶中培养，工作体积范围为 125 毫升至 2 升。我们采用了文献中报道的标准条件（4、5、38、39）。
STR 中的细胞生长和 rAAV 生产：我们进行了不同的研究，以建立缩小模型的 STR 操作条件。具体来说，我们研究了溶解氧浓度 (%DO sat ) 级联和比例-积分-微分 (PID) 控制参数的设置，以匹配不同规模的细胞生长和 rAAV 生产方面的性能。已发布的在 STR 中培养昆虫细胞和生产 rAAV 的实验条件是工艺优化的起点(38–40)。我们在高通量 (<0.5 L)、台式 (<5 L) 和技术转移规模 (<100 L) 下通过实验评估了细胞生长。根据我们之前的方案分析，选择了不同的操作参数迭代，以中试规模 (>100 L) 获得的数据作为我们的优化目标。在选定成功的条件后，我们对所有规模的 rAAV 生产流程进行了挑战，以验证其可扩展性，并以统计上可比的（t检验中置信度为 95%）产品产量和主要产品关键质量属性 (CQA)，即传染性和空衣壳与满衣壳 ( E : F ) 比率的形式证明了相似的性能。
